Microscopie : fixer la vie dans l’azote liquide

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janvier 2012
Cet appareil, le cryoultramicotome, est refroidi à l'azote liquide pendant les manipulations pour ne pas rompre la chaîne du froid. Il permet de trancher le bloc de glace amorphe contenant l'échantillon en tranches très fines. Celles-ci sont ensuite déposées sur une grille pour l'observation dans le cryomicroscope électronique.
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Pour ces chercheurs, le froid est un allié, non pas pour conserver mais pour faire de l’observation au microscope.

Dans le laboratoire Structure et dynamique des macromolécules de l’Université de Rennes1, la chaîne du froid, on connaît.

Deux microscopes électroniques sont équipés de chambres refroidies à l’azote liquide (-196°C) pour observer des échantillons cryogénisés.

« Ce sont des cryomicroscopes électroniques, explique Annie Cavalier, ingénieur d’étude CNRS, responsable des préparations des échantillons, qui a ramené la méthode de cryo-ultramicrotomie dans le laboratoire. Cela suppose qu’à partir du moment où l’on collecte l’échantillon jusqu’à celui où il est observé au microscope, il ne remonte jamais au-dessus de -150°C. »

Des cellules dans leur état naturel

Pourquoi travailler dans des conditions si contraignantes ? Pour pouvoir observer l’intérieur des cellules dans les conditions les plus naturelles possibles. La cryogénie permet de ne plus utiliser de produits chimiques pour fixer l’échantillon. « Utiliser des produits chimiques perturbe l’organisation de la cellule et la structure de ses composants. Or nous cherchons, par exemple, à reconstituer une image en 3D de l’intérieur de la cellule à l’état naturel. Pour cela nous utilisons une méthode de congélation sous haute pression (2 100 bars) qui fixe instantanément l’échantillon. » Dans ces conditions, l’eau contenue dans les cellules n’a pas le temps de former des cristaux, elle se fige en un seul bloc, dans un état que l’on appelle la glace amorphe. « C’est comme si on fixait un organisme, à un instant de sa vie, dans un bloc de glace qui serait aussi transparent qu’une vitre. Grâce au cryo-ultramicrotome (lui aussi refroidi à l’azote liquide), nous pouvons découper des tranches de moins de 50nm (50 millionièmes de millimètre !) dans les cellules ainsi fixées. » Et en observant chaque coupe les unes après les autres, une image en 3D des mitochondries, des ribosomes, des protéines, mais aussi de virus peut être reconstituée.

Quinze jours de préparation

Mais les chercheurs voudraient aller plus loin dans leurs explorations : ils aimeraient pouvoir localiser certaines protéines et certains acides nucléiques dans la cellule, ce qui suppose de pouvoir les marquer à une étape du processus de fabrication de l’échantillon. « Mais pas au début, puisque nous voulons observer les cellules à l’état naturel. »

La méthode consiste à congeler sous haute pression l’échantillon, puis à faire remonter la température jusqu’à -90°C tandis que l’on infiltre de la résine qui va se substituer à l’eau contenue dans l’échantillon pour le solidifier. « Cette substitution dure deux à trois jours. » Ensuite l’échantillon est remonté à -60°C, puis -30°C. À cette température il est soumis à des rayons UV qui vont provoquer la polymérisation de la résine. « Cette température de -30°C est importante car elle permet de piéger la chaleur émise lors de la polymérisation. » Ensuite, le bloc d’échantillon devenu solide peut être ramené à température ambiante et les marquages peuvent être effectués, sans risque de perturbations. « Il faut près de 15 jours pour effectuer la préparation d’un tel échantillon. » C’est long, mais grâce à ces techniques, les scientifiques sont désormais capables de visualiser l’organisation du vivant au niveau macromoléculaire. « Un peu comme si on photographiait l’intérieur des cellules ou des virus... »

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Christelle Garreau

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